• 免費服務熱線
  • 400-065-6886
  • 電話:86(0)512-6295 9990
  • 傳真:86(0)512-6295 9995
公司公告

祝賀!天昊生物轉錄組測序助力客戶發現母體低膽堿攝取調控新機制

發稿時間:2021-03-03來源:天昊生物


膽堿是一種必需的營養物質,也是甲基的主要飲食來源,對大腦發育至關重要。母體孕期飲食中的低膽堿(LC)會改變胎兒大腦的神經發生,并導致較低的認知能力。但是,胎兒神經祖細胞(NPC)發育期間對母體膽堿供給敏感性的關鍵信號傳導途徑,以及膽堿調節基因表達的表觀遺傳機制仍不完全清楚。在E11-17期間,給懷孕的Nestin-CFPnuc轉基因小鼠喂食對照飲食或LC飲食,通過轉錄組測序鑒定出E17時期NPC中的基因表達變化。母體LC飲食顯著增加Tlr4轉錄,導致神經元過早分化,并增強乙醇誘導的NLRP3炎性小體活化。在Tlr4基因啟動子區域未檢測到DNA甲基化的改變;但是,在LC處理的NPC中,H3K27me3降低了70%。抑制EZH2可降低H3K27me3水平并增加Tlr4表達。相反,使用具有無催化活性Cas9EZH2來增加Tlr4啟動子上的H3K27me3會導致Tlr4表達降低。這些結果揭示了母體膽堿的利用對胎兒大腦發育影響的表觀遺傳機制,提示了對神經發育疾病進行干預的可能性。



母體膽堿的可用性對胎兒大腦發育至關重要。在妊娠早期,母體飲食中膽堿攝入量低會增加胎兒神經管閉合缺陷。在妊娠后期,低膽堿(LC)母體飲食導致E11-17小鼠胚胎皮質和海馬體的持續變化,這是神經發生的敏感窗口。本文研究者曾經報道過,由于母體膽堿攝入量低會造成細胞周期提前結束、神經祖細胞(NPC)增殖減少和神經元分化加速,從而導致永久破壞胎兒大腦皮層中第II–IV層和第VI層的形成。此外,在懷孕期間吃LC食物的母鼠所生的后代對長時程增強作用不敏感,成年后視覺空間和聽覺記憶下降。雖然孕期母體攝入足夠膽堿對后代的正常認知能力至關重要,但其潛在的分子機制仍不清楚。

本研究檢測了小鼠母體低攝入膽堿量對胎鼠神經發生過程中表觀遺傳機制的影響。在這里,研究者報道了Toll樣受體4 (TLR4)信號通路對胎兒神經原細胞的神經元分化和神經炎癥至關重要。本文還首次證明了H3K27me3在特定基因調控中的功能相關性,這是通過使用基于CRISPR/dCas9的工具編輯NPCs Tlr4基因座的H3K27me3而揭示的。這些發現闡明了表觀遺傳變化和膽堿可用性之間的因果聯系,膽堿可用性改變了大腦的發育過程。



本文使用C57BL/6J背景的Nestin-CFPnuc轉基因小鼠(其中CFP與Nestin調控元件驅動的NLS融合)。在所有實驗中,8-15周齡的雌性小鼠進行受孕。在E11結束時,將動物隨機分配到2個喂養組之一:CT (1.10 g氯化膽堿/kg)和LC (0 g氯化膽堿/kg),動物被喂食這些食物直到E17。E14 NPCs細胞根據之前報道方法進行分離和培養,在含有70 μM氯化膽堿(對照)或5μM氯化膽堿(LC)的培養基中處理。

RNA-Seq由上海天昊生物科技有限公司進行。從E17 Nestin-CFPnuc小鼠收集皮質CFP+ NPC樣品,并從提取的樣品構建RNA測序文庫,然后使用標準Illumina文庫制備方案擴增RNA。RNA-Seq是在Illumina HiSeq 2500平臺上進行的。此外,本研究還進行了qRT-PCR、Western blot雜交、焦磷酸測序、H3K27me3染色質免疫沉淀(ChIP),以及基因編輯實驗等。



RNA-Seq分析確定了LC處理的E17 NPCs轉錄譜的顯著變化


利用轉錄組測序獲得了差異表達基因熱圖(圖1A)。與對照NPCs細胞相比,在LC中暴露的NPCs細胞大多數基因(80%)表達上調,表明處理的細胞中具有更活躍的轉錄過程。在火山圖中,表達差異顯著基因顯示為紅色(上調基因)和綠色(下調基因)(圖1B)。KEGG分析表明,在E17 NPCs中,與軸突導向、TLR信號通路和細胞周期相關的基因受到LC的顯著調節(圖1C)。



選擇這些功能類別進行驗證,列出了LC NPCs中10個最重要的上調基因(圖2A),并通過qRT-PCR進行驗證,結果數據一致(圖2B)。Tlr4是受母體LC飲食顯著影響的最高表達基因之一。使用蛋白質印跡法來證實經LC處理的E17 NPCs中TLR4蛋白表達的顯著變化(圖2C)。這些發現促進了對由母體膽堿缺乏引起的NPCs TLR4表達變化結果的研究。



隨后研究者通過逆轉錄病毒感染等實驗證明,Tlr4過表達促進神經元分化但不促進NPCs的增殖,但通過對Tlr4敲降,可以恢復LC誘導的NPC分化。TLR4在LC處理的NPCs中加重乙醇誘導的NLRP3炎癥小體的激活(原文圖3-5)。


H3k27me3降低與LC處理的NPCsTlr4表達上調有關


LC條件下Tlr4基因表達與NPCs分化和炎癥小體激活之間具有顯著的正相關性,一個可能的機制是Tlr4通過其DNA和組蛋白甲基化狀態來調控轉錄。研究者因此使用WashU表觀基因組瀏覽器(http://epigenomegateway.wustl.edu)搜索Tlr4基因啟動子的CpG位點和組蛋白甲基化富集位點。本文選擇組蛋白修飾H3K4me3、H3K9me3和H3K27me3,因為H3K4me3與激活轉錄有關,而且H3K9me3和H3K27me3是啟動子區轉錄基因沉默的標志。圖6A顯示了CpG位點的示意圖,由RNA聚合酶II (POLR2A) ChIP-seq信號和ES-Bruce4細胞系(一種小鼠胚胎干細胞系)的組蛋白修飾數據揭示的Tlr4的轉錄活性。

這些數據表明表觀遺傳系統可能在皮層NPCs Tlr4表達中起重要作用。研究者首先進行焦磷酸測序,以確定在LC條件下Tlr4啟動子區域是否發生了DNA甲基化水平的降低。從Tlr4基因啟動子到最接近TSS的內含子1開始的10個CpG位點沒有觀察到可檢測的DNA甲基化變化(圖6B)。然后研究者分析了組蛋白甲基化是否與LC暴露后NPCs中的Tlr4啟動子相關。

ChIP-qPCR實驗發現LC處理導致Tlr4啟動子H3K27me3的富集減少70%,而H3K4me3或H3K9me3水平沒有顯著差異(圖6C)。為了確定H3K27me3標記減少是否激活Tlr4轉錄,研究者將培養的NPCs暴露于H3K27me3組蛋白甲基轉移酶EZH2的抑制劑EPZ-6438中。在培養的NPCs中,用EPZ-6438抑制EZH2導致H3K27me3的整體水平降低60%(圖6D),在Tlr4啟動子H3K27me3富集的顯著減少情況下(圖6E),Tlr4 mRNA表達(圖6F)和蛋白質水平(圖6G)增加。這些結果表明由LC誘導的H3K27me3的降低與NPCs中Tlr4的上調有關。


H3k27me3的表觀遺傳編輯調節Tlr4基因表達


為了進一步評估H3K27me3的變化是否為調節Tlr4基因表達的原因,研究者設計并檢測了幾個小的gRNAs,它們定位在靠近Tlr4 TSS的保守H3K27me3富集位點(圖6A,7A)。

然后用CRISPR/dCas9-EZH2系統的慢病毒感染NPCs(圖7B)。靶向Tlr4的dCas9-EZH2系統轉導后,TLR4陽性細胞在基因編輯細胞中的比例(由PaprikaRFP反應)與對照gRNA組相比顯著降低,為了排除TLR4表達減少是由空間位阻而不是表觀基因組編輯引起的可能性,研究者還導入了SET結構域(EZH2*)中突變的EZH2,其具有非活性組蛋白甲基轉移酶結構域。

靶向Tlr4的dCas9-EZH2*的轉導不影響TLR4陽性細胞的比例(圖7C和D),暗示表觀基因組編輯通過H3K27me3標記修飾來抑制Tlr4基因表達。為了測試由CRISPR/dCas9-EZH2引起的Tlr4轉錄抑制是否與H3K27me3直接相關,本研究進行了ChIP-qPCR實驗。與對照水平相比,dCas9-EZH2靶向Tlr4后,Tlr4周圍的H3K27me3水平顯著增加,但dCas9-EZH2*靶向Tlr4后未觀察到此類增加 (圖7E)。基于CRISPR/Cas9的表觀基因組編輯研究結果表明H3K27me3可以改變靶基因Tlr4在NPCs中的表達

本研究結果為TLR4在胎兒腦神經發生中的關鍵作用提供了第一個證據,并表明神經炎癥和腦損傷可能是由母體攝入乙醇引起的。該結果還提供了關于神經發育過程中膽堿需求和單個基因水平上功能性組蛋白修飾變化的新信息。這些結果有助于我們理解飲食膽堿如何調節胎兒大腦發育,并可能為預防神經發育疾病的新干預策略的發展提供思路。


往期文章鏈接:

轉錄組Plus | 2020年12月研究進展(一):早產、衰老和蘋果果肉品質等

轉錄組Plus | 2020年11月研究進展:肝炎、紅斑狼瘡、病毒-真菌共感染和珊瑚漂白等

轉錄組Plus | 2020年10月研究進展:血小板、COVID-19、胃癌、啶酰菌胺暴露及最新lncRNA數據庫等

轉錄組Plus | 2020年9月研究進展(二):阿爾茨海默癥、結直腸癌、精索靜脈曲張、納米聚苯乙烯毒性和香蕉果實成熟等;

轉錄組Plus | 2020年9月研究進展(一):蒙古人肝癌、胰腺癌、果實發育、豬基因組印記等;

轉錄組Plus | 2020年8月研究進展(一):心臟器官發生、癡呆、哮喘、家蠶氟暴露、水稻病毒響應及蘋果采后保鮮;

轉錄組Plus | 2020年7月研究進展(二):阿爾茨海默癥、膠質母細胞瘤、COVID-19、牛酮癥、玉米耐低溫等;

轉錄組Plus | 2020年7月研究進展(一):黑色素瘤、抑郁癥、CNV疾病、植物不定根發生等;

6個樣本全轉錄組測序,輕松斬獲4.2分文章;

全轉錄組測序在植物研究中的應用(黃瓜、番茄、大白菜、泡桐、擬南芥、茶樹、胡楊、玉米)

全轉錄組測序在動物研究中的應用(小鼠、大鼠、兔、豬、牛、雞、羊);

mRNA/lncRNA/miRNA綜合研究思路解讀;
PceRBase:第一個植物ceRNA數據庫;
【昊閱讀】LncRNA研究,像這個夏天一樣“火熱異常”;
一套RNA-Seq數據發兩篇文章,這篇5分文章可能被你漏掉了;
【昊閱讀】RNA-seq揭示油茶冷適應的分子機制;
【昊閱讀】Nature:寄生過程“microRNAs制導炮彈”被發現;

【昊綜述】環狀RNA全方位觀察:從生物發生到功能;


Copyright ? 2012-2021 天昊基因科技(蘇州)有限公司    All Rights Reserved    蘇ICP備17064027號-1
国产精品三级黄色片_国产亚洲日韩在线播放不卡_国产乱色_欧美乱色视频_日本高清视频wwwwg色