• 免費服務熱線
  • 400-065-6886
  • 電話:86(0)512-6295 9990
  • 傳真:86(0)512-6295 9995
公司公告

【昊文章】上海六院最新研究成果發現Paget's骨病新致病基因!

發稿時間:2021-04-02來源:天昊生物


    Paget’s骨病(PDB)是一種慢性進展性代謝骨病,以破骨細胞的異常激活為特征,導致骨吸收增加和代償性骨形成、骨硬化。PDB能夠影響骨骼的某個或多個區域,伴有多種臨床表現,包括骨痛、骨骼和關節畸形、病理性骨折、耳鳴、聽力下降以及視力喪失等。

骨腫瘤是PDB最嚴重的并發癥,其中最常見類型為骨肉瘤,發生率為1%,其風險增加是普通人群的數千倍。其次還可并發纖維肉瘤、軟骨肉瘤以及骨巨細胞瘤(Giant Cell Tumor,GCT),其中合并GCT非常罕見,并且這一疾病的發病機理仍不明確。

遺傳是PDB發病的重要因素之一,報道發現SQSTM1、TNFRSF11A、TNFRSF11B、VCP、HNRNPA2B1等基因的突變與PDB相關。ZNF687曾被報道與意大利南部幾例PDB/GCT患者有關,然而,PDB和PDB/GCT的分子機制仍未完全解析,上述的已知基因只能解釋其中一小部分病例。

課題組于2017年和2019年分別收集到兩個早發型PDB伴GCT(PDB/GCT)家系樣本,其中家系一包含祖孫三代24位成員,10位成員以常染色體顯性方式被診斷為PDB(圖1,診斷資料詳見原文),所有的患者呈現出PDB多骨侵犯(至少3個部位骨骼受累),并且發病年齡呈早發型。家系二包括母子兩代4位成員,先證者和其母親以常染色體顯性方式被診斷為PDB(診斷資料詳見原文)。這項研究同時納入了30例PDB散發患者,這些患者均未檢測出與PDB相關的已知基因突變。研究另外招募了570名健康漢族人群志愿者作為對照,檢測健康人群中的突變頻率。


    為了發現PDB/GCT的致病基因,研究人員對家系一15位成員進行連鎖分析,并對患病的6位成員(II-2、II-4、II-5、II-9、III-4和III-9)進行全外顯子組(WES)測序。多點參數連鎖分析在染色體17:8、547-5、657和423的LOD分數最高,為2.70(圖2A)。研究通過WES鑒定出73個功能變異,但只有2個在關鍵連鎖區域內。進一步通過Sanger測序發現只有1個與疾病表型顯示出精確的共分離:PFN1基因的c.318_321delTGAC雜合突變(p. Asp107Argfs*3),編碼Profilin 1蛋白,該基因位于染色體17p13(圖2B)。該突變位點4bp的缺失會導致一個提前終止密碼子的移碼突變,形成一個由108個氨基酸而不是140個殘基組成的蛋白。研究人員又利用Sanger測序在1例散發患者中發現了PFN1基因的另一個相鄰位置的缺失突變(圖2B),c.324_324delG雜合突變(p.T109Rfs*2)。而在家系二成員(I-2)中鑒定到PFN1的c.335 T > C錯義突變(p.Leu112Pro,圖2B),這些研究結果表明PFN1的截短型突變和錯義突變均是PDB/GCT的致病突變,而在健康對照中并未發現以上類型的突變。



    接下來研究人員在113例單純GCT患者的腫瘤樣本中分析PFN1基因是否存在體細胞突變,結果并未檢測出PFN1體細胞突變存在。為了驗證患者的破骨細胞是否具有典型的Pagetic破骨細胞特征,研究人員分別從健康對照和患者(家系一III-9)的外周血中分離出單個核細胞,并將其向破骨細胞誘導分化。正如預期,研究人員觀察到PFN1突變的PDB患者破骨細胞數量及大小遠高于對照組(圖3)。



    為了研究PFN1突變在PDB發病機制中的功能,利用CRISPR-Cas9技術構建了Pfn1突變小鼠,Pfn1 c.318–321缺失純合突變對于小鼠胚胎形成是致死的,Pfn1+/mut小鼠與野生型(WT)小鼠相比,突變小鼠從出生到成年,體型較野生型更小,體長和股骨長度縮短,顱面骨和脊柱表型明顯差異(圖4A)。MicoCT 3D重建顯示與WT小鼠相比,Pfn1+/mut小鼠的顱縫較寬,顱面骨和脊柱后凸畸形(圖4B)。另外,Pfn1+/mut小鼠骨小梁參數顯示較WT骨量明顯減少(圖4C)。